1.限制性內(nèi)切酶實(shí)驗(yàn)問(wèn)題指南

2.高保真限制性內(nèi)切酶常見問(wèn)題解答

Q. 為什么 HF 內(nèi)切酶推薦使用的緩沖液與野生型的內(nèi)切酶不同？

A. 在許多情況下，突變導(dǎo)致高保真內(nèi)切酶的最適緩沖液發(fā)生變化。比如，野生型 SalI 酶的最適緩沖液 NEBuffer 3.1 是高離子強(qiáng)度緩沖液，然而 SalI-HF^? 的最適緩沖液為中等離子強(qiáng)度的 NEBuffer 2.1 和 CutSmart。

Q. 使用 CutSmart 緩沖液有什么優(yōu)勢(shì)嗎？

A. 是的，超過(guò) 200 種限制性內(nèi)切酶（包括高保真限制性內(nèi)切酶）在 CutSmart 緩沖液中有活性。當(dāng)建立雙酶切
反應(yīng)時(shí)有很大優(yōu)勢(shì)。 

3.轉(zhuǎn)化反應(yīng)問(wèn)題解決指南                

下面的指南可用于解決轉(zhuǎn)化過(guò)程中所出現(xiàn)的問(wèn)題。

無(wú)菌落或液體培養(yǎng)基中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)
? 即使 T7 表達(dá)為嚴(yán)格調(diào)控型，但是 T7 表達(dá)宿主菌中也可能存在低水平的基礎(chǔ)表達(dá)。如果表達(dá)的蛋白可能有毒
  性，表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化應(yīng)使用下列系統(tǒng)：
? I^q 菌株中過(guò)量表達(dá)的 LacI^q 抑制物能夠降低 T7 RNA 聚合酶的基礎(chǔ)表達(dá)。
? 在 lysY 菌株中，突變的 T7 溶解酶與 T7RNA 聚合酶相結(jié)合，從而減少目的蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)。誘導(dǎo)后，新合
  成的 T7 RNA 聚合酶抵消了溶解酶作用，目的蛋白得到表達(dá)。
? 30℃ 或室溫培養(yǎng)也可減輕毒性問(wèn)題。
? 檢查抗生素濃度（用對(duì)照質(zhì)粒檢測(cè)）。、

電泳無(wú)蛋白或無(wú)蛋白活性
? 檢查毒性—細(xì)胞可能刪除或缺失了表達(dá)質(zhì)粒的元件。如果有毒性表達(dá)問(wèn)題，試用I^q和/或 lysY 宿主以減少基礎(chǔ)
  表達(dá)。
? 培養(yǎng)用于誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的細(xì)胞。誘導(dǎo)前，將樣品平行涂布于有抗生素和無(wú)抗生素選擇標(biāo)記的平板。如果有毒性
  產(chǎn)生，則兩個(gè)平板菌落數(shù)會(huì)有顯著的不同。在含抗生素的平板上，菌落生長(zhǎng)數(shù)量極少（表明質(zhì)粒丟失了）。

誘導(dǎo)蛋白不可溶

T7 表達(dá)蛋白經(jīng)常產(chǎn)量非常高，導(dǎo)致目的蛋白不可溶，解決方案如下：
? 低溫誘導(dǎo)（低溫 12-15℃ 過(guò)夜）
? 降低 IPTG 濃度至 0.01 mM-0.1 mM
? 縮短誘導(dǎo)時(shí)間（可以縮短至 15 分鐘）
? 細(xì)胞生長(zhǎng)早期開始誘導(dǎo)（OD₆₀₀ = 0.3 或 0.4）