蛋白印跡實(shí)驗(yàn)封閉蛋白選哪種，牛奶或 BSA？

脫脂奶粉或牛血清白蛋白 (BSA) 會(huì)如何影響你的蛋白印跡結(jié)果。

關(guān)于蛋白印跡 WB 實(shí)驗(yàn)，我們常遇到一個(gè)問題，我該用什么來封閉，牛奶或 BSA？

首先，我們需要了解封閉的目的：減少因非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景。其次，我們需要知道 BSA 和牛奶的區(qū)別：BSA 僅由一種蛋白組成，即 60 kDa 的牛血清白蛋白；而牛奶則由許多大小不一的蛋白構(gòu)成。

所以，CST (Cell Signaling Technology) 推薦牛奶封閉最佳，因?yàn)榕Ｄ逃懈蟮臋C(jī)會(huì)來減少更多的非特異性結(jié)合。我們建議您用經(jīng) TBST 稀釋的 5% 牛奶，在室溫下?lián)u晃一小時(shí)，來封閉CST所有非偶聯(lián)一抗，這包括磷酸化特異性和總抗體。

現(xiàn)在，曾有同學(xué)問過，“牛奶中的磷酸酶會(huì)怎么樣？” 或許有一些文章反對(duì)使用牛奶來檢測(cè)磷酸化信號(hào)，這一誤區(qū)的出現(xiàn)可能是由于實(shí)驗(yàn)者使用了非實(shí)驗(yàn)級(jí)奶粉引起的（國內(nèi)許多奶粉含有磷酸酶等雜質(zhì)），但在 CST 的所有內(nèi)部檢測(cè)中，科學(xué)家們進(jìn)行了多次蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，從未發(fā)現(xiàn)任何這樣的問題。CST建議轉(zhuǎn)膜后迅速在TBS中洗滌膜幾秒，以便移除殘留的轉(zhuǎn)膜緩沖液，隨后使用5%脫脂牛奶（請(qǐng)使用實(shí)驗(yàn)級(jí)的#9999）的TBST室溫封閉1h。另外，CST科學(xué)家們每天至少要新鮮配制一次牛奶，有時(shí)甚至一天配制多次，因?yàn)槿绻Ｄ叹彌_液放置了一周、兩周甚至更長時(shí)間不使用，那么磷酸酶影響信號(hào)的機(jī)率將會(huì)增加。

上圖是(Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP??Rabbit mAb)?#13038 用來檢測(cè)經(jīng) PDGF 處理的 3T3 細(xì)胞裂解物的結(jié)果圖片。左側(cè)膜是用牛奶封閉，右側(cè)膜用 BSA 封閉。顯然，用 BSA 封閉的膜的背景更高。但用牛奶封閉膜時(shí)，磷酸化信號(hào)仍然很強(qiáng)且清晰。

封閉后，請(qǐng)仔細(xì)查看一抗的說明書，根據(jù)推薦的一抗緩沖液來稀釋一抗，一般推薦牛奶或 BSA，但取決于不同抗體。

希望本篇講述的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)對(duì)您的實(shí)驗(yàn)有所幫助。全部特定應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)步驟可在 cst-c.com.cn 具體產(chǎn)品頁上找到。如果你有任何其他技術(shù)問題，請(qǐng)郵件聯(lián)系tech@cst-c.com.cn，或可撥打全國免費(fèi)技術(shù)熱線：4006-GreatQ（473287）。

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